Biológicamente, la pulpa y la dentina forman un complejo funcional que debe ser estudiado como un solo tejido. Cuando el complejo pulpo dentinario se infecta, los tejidos reaccionan a la invasión microbiana para erradicarla. La habilidad del complejo de llevar a cabo esta función no debe ser subestimada, debido a que los tejidos están dotados con procesos inmunocompetentes. Sin embargo, en términos clínicos, si la ruta de infección no es erradicada por estos procesos naturales o por procesos operativos, la carga de microorganismos que invade el complejo supera las defensas y causa enfermedad, como pulpitis, necrosis e infección de la cámara pulpar y conducto radicular.4
De este modo, la estructura y composición de la matriz de dentina y de los túbulos dentinarios son factores clave en el proceso de invasión de los microorganismos, debido a que la dentina es porosa, dura y contiene tejido conectivo mineralizado compuesto principalmente por hidroxiapatita cubierta por fibras de colágena tipo I, así como otros tipos de colágena (III, V y VI), proteínas no colágenas y proteoglicanos que están presentes como componentes menores. El fluido del túbulo dentinario contiene suero con proteínas, como albumina, IgG y otras proteínas de sangre, como fibrinógeno,4 las cuales funcionan como fuente de nutrición y sustrato de adhesión para los microorganismos dentro del túbulo dentinario.2 El aporte nutricional limitado puede influir en la profundidad de la penetración e invasión bacteriana.
La invasión de túbulos dentinarios por microorganismos de la placa subgingival y supragingival ocurre siempre y cuando la dentina esté expuesta en la cavidad oral, esto puede ser a través de lesiones cariosas, procedimientos restaurativos o periodontales, fisuras de esmalte o dentina, o trauma dental.4 La penetración de microorganismos a los túbulos es menor en pre sencia de smear layer y el grado de inflamación pulpar es menos pronunciado.2, 4 Se ha demostrado en estudios previos que el grabado de la dentina, antes de la exposición a microorganismos, resulta en una mayor penetración.2
Las infecciones persistentes del conducto radicular están relacionadas con la retención de microorganismos en el tejido dentinario,5 ya sea antes o durante el tratamiento endodóntico,6 donde los microorganismos implicados con más frecuencia son el E. faecalis y la levadura C. albicans.
Las levaduras son patógenos oportunistas comunes en la cavidad oral.7 Investigaciones microbiológicas han mostrado que las levaduras pueden ser aisladas de un 1 - 17% en infecciones persistentes de los conductos radiculares, en cultivos puros o junto con otras bacterias.8 De éstas, Candida albicans es la más frecuentemente aislada 9 en cavidad oral, principalmente en placa dental, caries dental, flora subgingival y conductos radiculares.10
C. albicans ha demostrado que posee atributos de virulencia que juegan un papel importante en el proceso infeccioso. Los mecanismos involucrados en la patogénesis son: 1) adaptabilidad a la variedad de condiciones ambientales, 2) adhesión a las distintas superficies (tigmotropismo), 3) producción de enzimas hidrolíticas, 4) transición morfológica, 5) formación de biofilm y 6) evasión e inmunomodulación de las defensas del huésped.11
De este modo, C. albicans puede utilizar la dentina como fuente de nutrición.12 Esta afinidad de invasión dentinaria ha distinguido a C. albicans como un microorganismo dentinofílico 13 capaz de unirse al colágeno tipo I y IV y de coagregarse con varias bacterias orales.
El género Enterococo también ha sido implicado en infecciones endodónticas, particularmente E. faecalis ha sido aislado frecuentemente en dientes con conductos radiculares obturados, exhibiendo signos de periodontitis apical crónica en un 23 a 70%.
El E. faecalis tiene habilidad para penetrar de forma efectiva dentro de los túbulos dentinarios, mientras que no todas las bacterias la tienen,14 lo cual contribuye a su sobrevivencia durante el tratamiento químico mecánico del sistema de conductos8 y permite la colonización de los túbulos y la reinfección del conducto radicular obturado.15
Los factores de virulencia de E. faecalis están relacionados a la colonización del huésped, competición con otras bacterias, resistencia contra mecanismos de defensa y producción de cambios patológicos a través de la formación de toxinas e inducción de inflamación.16
Akpata y Blechman (1982) encontraron que tiempos incrementados de exposición de la dentina a bacterias, coincidían con un incremento en el número de túbulos infectados y en la cantidad de penetración; Ørstavik y Haapasalo (1990) confirmaron estas observaciones en su estudio in vitro, donde utilizaron E. faecalis y S. sanguis con una penetración a túbulos dentinarios con una profundidad de 300 a 400 μm en un lapso de dos a tres semanas.2 Adriaens (1988) concluyó que un factor importante en la invasión de túbulos dentinarios por bacterias es la disponibilidad de nutrientes.
Por ello, el objetivo de esta investigación fue observar la invasión a túbulos dentinarios de C. albicans y E. faecalis en periodos de 5, 10 y 15 días.
Materiales y métodos
Recolección y preparación de muestras
Se utilizaron 47 raíces unirradiculares de dientes humanos recién extraídos, los cuales fueron almacenados en hipoclorito de sodio al 0.01% a 4°C, después de la limpieza de la superficie radicular con curetas. Los segmentos radiculares se prepararon a una longitud de 7 mm como resultado del corte de la porción apical y de la porción coronal de 2 a 3 mm por debajo de la unión cemento esmalte, utilizando una fresa de diamante de alta velocidad bajo refrigeración constante con solución de buffer fosfato.
Posteriormente, cada conducto radicular fue ensanchado con una fresa peeso No. 2 a baja velocidad, bajo irrigación constante. Para la remoción de debri orgánico e inorgánico, incluyendo el smear layer, se utilizó un baño ultrasónico en EDTA al 17%, seguido por hipoclorito de sodio al 5.25%, por cuatro minutos cada uno. Se utilizó una irrigación final con solución de buffer fosfato (pH=7.2) para remover los restos de EDTA e NaOCl.2
Después, de forma aleatoria se tomó cierto número de muestras para verlas bajo el microscopio electrónico de barrido y corroborar la permeabilidad de los conductos. Luego, las muestras fueron esterilizadas en autoclave por 20 minutos a 121°C.
Las muestras permanecieron durante 24 horas sumergidas en 2 ml de suero fetal bovino en la campana de flujo laminar para su posterior infección. Éstas fueron divididas en tres grupos experimentales con 15 muestras cada uno, para los distintos periodos de tiempo (5,10 y 15 días) y un grupo control con dos muestras.
Infección de las muestras
Las cepas de E. faecalis y C. albicans fueron tomadas del Laboratorio de Microbiología de la Maestría en Endodoncia de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí. Ambos microorganismos fueron inoculados en un medio preparado con infusión cerebro corazón (BHI) y dextrosa sabouraud a una proporción 1:2, respectivamente. Se realizó tinción de Gram a las 48 horas de la inoculación para confirmar la interacción de los microorganismos.
Se utilizaron tres tubos con rosca, que contenían 6 ml de medio preparado (BHI, dextrosa sabouraud 1:2), un mililitro de suero fetal bovino (utilizado como sustrato para C. albicans), 2 ml del medio con ambas bacterias (un total de 9 ml en cada tubo) y 15 muestras en cada uno; esto fue realizado bajo condiciones de anaerobiosis.
Bajo estricta asepsia, el medio de cultivo (6 ml de BHI 1:2 dextrosa sabouraud) fue cambiado cada dos días por los distintos periodos de tiempo, en cada recambio se realizó tinción de Gram para confirmar la pureza y comprobar la interacción de los microorganismos.
Preparación de las muestras para ser observadas al MEB
Las muestras se lavaron tres veces con solución buffer fosfato 0.1 M y fueron colocadas en 10 ml de glutaraldehido al 2% (solución glutaraldehido Grado I al 25%), preparado para microscopía electrónica, con 10 ml de colorante alciano blue 8GX al 1% con un pH 2.5, y se almacenaron selladas con Parafilm durante 24 horas a 4°C. Posteriormente, las muestras fueron lavadas con solución buffer fosfato, para eliminar el exceso de colorante, y llevadas al proceso de deshidratación por medio de alcoholes crecientes, etanol anhidro reactivo al 20%, 40%, 60%, 80%, 90% y 95% durante 10 minutos en cada uno de ellos, para finalmente ser almacenadas en alcohol al 99.98%, hasta ser llevadas al proceso de secado de punto crítico de CO2.
Se procedió a realizar el baño de oro y la observación bajo microscopio electrónico de barrido a distintas magnificaciones.
Resultados
Se observó la permeabilidad de los túbulos dentinarios y la ausencia total de algún tipo de microorganismos en el grupo control (Figuras 1 y 2).
Figuras 1 y 2. Microfotografías con microscopio electrónico de barrido, muestran túbulos dentinarios permeables después del tratamiento con NaOCl y EDTA a una magnificación de 1000x y 2000x, respectivamente.
El análisis bajo microscopía electrónica de barrido reveló que los microorganismos utilizados en este experimento fueron capaces de penetrar dentro de los túbulos dentinarios. La cantidad y profundidad varió en los tres grupos experimentales; en el grupo de los cinco días se observó la presencia de túbulos dentinarios permeables, presencia de E. faecalis en poca cantidad y profundidad, C. albicans se observó solamente en forma levaduriforme (Figuras 3 y 4)
Figura 3. Se observa un corte transversal de túbulos dentinarios con poca cantidad de microorganismos y poca penetración a una magnificación de 2500X.
Figura 4. Corte longitudinal de túbulos dentinarios a una magnificación de 4000X a los 5 días.
En el grupo experimental de diez días de inoculación se mostró una mayor invasión a túbulos dentinarios; en cuanto a cantidad y profundidad, se observó en mayor cantidad la presencia de E. faecalis. C. albicans presentó morfología levaduriforme y expresión de hifas (Figuras 5 y 6).
Figura 5. Corte transversal donde se observa penetración a túbulos dentinarios
en una magnificación de 2000X.
Figura 6. Corte longitudinal donde se observa una gran cantidad de E. faecalis y C. albicans en formas levaduriformes y expresión de hifas, a una magnificación de 3000X.
El grupo experimental de 15 días de inoculación mostró un asentamiento bacteriano donde se observó poca o nula permeabilidad de los túbulos dentinarios, exhibiendo de forma notoria un aumento sustancial en la cantidad tanto de E. faecalis como de C. albicans en forma de hifas, las cuales se interconectaban formando una red y presentando colonias densas (Figuras 7 y 8)
Figura 7. Corte transversal de túbulos dentinarios infectados a una magnificación 3000X.
Figura 8. Corte longitudinal de túbulos dentinarios a una magnificación de 1000X.
Discusión
En el presente estudio se observó la invasión a túbulos dentinarios humanos con E. faecalis y C. albicans bajo MEB, donde fue evidente el incremento en la invasión y en la penetración dentro de los túbulos conforme aumentaba el tiempo de exposición. No ha habido reportes previos donde se observe la invasión a túbulos dentinarios con la infección de ambos microorganismos, sólo se han evaluado de forma separada.
El modelo experimental mostró diferencias en la velocidad de penetración entre los microorganismos, lo cual indica irregularidad en el crecimiento de C. albicans en la dentina, en comparación con E. faecalis. Esto probablemente sea debido a la diferencia que existe en el tamaño de los microorganismos,8 así como también al factor de morfología bacteriana.6, 20
La penetración de C. albicans dentro de los túbulos dentinarios fue infrecuente, en lo cual coincidimos con lo reportado por Siqueira (2002) quien menciona que las levaduras usualmente no forman filamentos o micelios, sin embargo, bajo ciertas condiciones, algunas levaduras pueden formar una fase filamentosa. C. albicans es descrita como una leva dura polimórfica porque se puede observar en forma de blastoespora, tubo germinal, hifa verdadera, pseudohifa y clamidioespora dependiendo de las condiciones del ambiente. Ha sido sugerido que la transición de blastoespora a hifa representa una diferencia en el cambio de comensal a patógeno, aunque no siempre es un prerrequisito para que la infección ocurra.17, 18
En este estudio se trató la superficie dentinaria con un baño ultrasónico con EDTA, seguido de hipoclorito de sodio, lo cual, según lo reportado anteriormente, causa decremento en la cantidad de dentina orgánica e inorgánica disponible y esto no favorece la expresión micelial de C. albicans.19 Además, se realizó la remoción de smear layer. Investigaciones previas sugieren que la presencia de éste favorece el crecimiento y expresión de C. albicans en los túbulos dentinarios,7 esto pudiera explicar la pobre expresión de hifas que observamos en nuestros resultados.
Conclusiones
1 - Se observó invasión tanto de C. albicans como de E. faecalis en túbulos dentinarios.
2. Se observó la expresión en forma de hifas de C. albicans solamente en el periodo de 10 y 15 días de inoculación y esta expresión fue escasa.
3. Se observó diferencia tanto en la cantidad de bacterias como en la coagregación y penetración de éstas a distintos periodos de tiempo; fue más evidente a los 15 días.
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