► Introducción

La lecitina biomimética es una combinación de ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido araquidónico, ácido linoleico y ácido linolénico, en conjunto con otros ácidos grasos esenciales saturados, monosaturados y poliinsaturados (15 ácidos grasos diferentes), que por su homología estructural con los ácidos grasos de la membrana plasmática neuronal participan en el desarrollo del cerebro y en la función neuronal. En particular, los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, polyunsaturated fatty acid), DHA y EPA, son fundamentales en la síntesis de la membrana neuronal (el DHA permite el aumento de los valores de ácido fosfatídico y de proteínas sinápticas) y en la formación de las sinapsis (incrementan el número de espinas dentríticas en las neuronas del hipocampo). De esta manera, estos PUFA, pertenecientes a la serie n-3 (omega 3), permiten al cerebro nutrirse con compuestos esenciales ricos en ácidos grasos, como la esfingomielina (fosfolípido glicerolado) y los fosfolípidos, que presentan en su estructura fosfatidil etanolamina, fosfatidil colina, fosfatidil serina y fosfatidil inositol, los cuales son claves en la neurotransmisión (fusión y reciclaje de vesículas sinápticas). Al participar en los mecanismos antes mencionados, los PUFA promueven la maduración de la neurona (arborización dendrítica y ramificación axonal), ya que favorecen la estabilidad sináptica y regulan el crecimiento y la extensión de las neuritas. En este sentido, los cambios estructurales y funcionales en los cuales se encuentran implicados los PUFA inciden en las capacidades cognitivas y de aprendizaje, en la sinaptogénesis y la plasticidad neuronal.

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto que la lecitina biomimética ejerce en la neurotransmisión, el crecimiento y la extensión de las neuritas y la formación de circuitos de neuronas corticales primarias.

► Métodos

Los componentes de los nanoliposomas de lecitina biomimética, denominados F22, fueron extraídos mediante procesos enzimáticos de cabezas de salmones y presentaron similitud estructural a los ácidos grasos y los fosfolípidos con diferentes cabezas proteicas hidrófilas encontrados en el cerebro humano. El F22 (en concentraciones de 5, 50 y 100 µg/ml) fue utilizado en cultivos de células neurales (1.5 x 104células por pocillo de placa de 96) derivadas de embriones de ratón de 18.5 días (medio de cultivo neurobasal suplementado con 12% de B27, 2 ml de glutamina y antibióticos). La actividad metabólica se evaluó de acuerdo con el protocolo del Cell Proliferation kit, en cultivos de 3, 7 y 10 días (el F22 fue aplicado al cultivo luego de 6 horas de crecimiento). La determinación de la ramificación de las neuritas y la complejidad de la red neuronal se realizó mediante la utilización del anticuerpo que detectaba beta-III tubulina (marcador de citoesqueleto) y el análisis morfométrico de Sholl, respectivamente. En los experimentos de electrofisiología, las neuronas corticales primarias (1 x 105) fueron cultivadas sobre matrices de microelectrodos (MME) en medio de cultivo específico. Con respecto a la actividad eléctrica detectada por los electrodos, se estableció que éstos debían registrar un mínimo de 3 espigas por minuto para ser considerados activos. Por otra parte, la frecuencia de estallidos de actividad fue determinada por el número de estallidos por minuto registrados por electrodos activos (los cuales registraban un mínimo de un estallido por minuto) y, asimismo, un estallido de actividad estaba representado por un mínimo de 4 espigas.

Para el análisis de expresión se extrajo el ARN total y se lo trató con ADNasa I. Se obtuvo el ADN copia a partir de 0.5 µg de ARN total de acuerdo con el protocolo de High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Manual. Se procedió luego a realizar una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con los primers específicos para sinapsina I y GAPDH y HPRT1 como controles internos.

En el análisis estadístico se utilizó ANOVA de una vía y el método de Bonferroni (actividad metabólica), la prueba de la t de Student (análisis Sholl), y ANOVA de dos vías y el método de Bonferroni (experimento de MME). Un valor de p < 0.05 fue considerado estadísticamente significativo, determinado por la prueba de la t de Student de muestras relacionadas.

► Resultados

Los nanoliposomas F22 contenían una mayor proporción (> 50%) de PUFA (30%, 10%, 6% y 5% de DHA, EPA, ácido linoleico y ácido linolénico, respectivamente) y un 20% de ácido oleico (ácido graso monoinsaturado). Asimismo, la fosfatidil colina fue el fosfolípido de mayor representación en los F22 (32% P/P).

La adición de los F22 (100 µg/ml) a cultivos de células neurales indujo un aumento significativo (p < 0.01) en el metabolismo oxidativo de las mitocondrias (que genera ATP necesario para la actividad celular), en comparación con el control (cultivos de 3 días). No obstante, dicho aumento pudo detectarse luego de 7 días de cultivo con F22 cuando se aplicaron concentraciones más bajas del nanoliposoma (5 µg/ml y 50 µg/ml). Por ello, la concentración más alta fue la utilizada en los experimentos subsiguientes y las evaluaciones de los cambios estructurales se realizaron en cultivos de 3 días.

En el estudio de crecimiento y extensión de neuritas, la lecitina biomimética indujo un aumento en la longitud y la complejidad de su ramificación, principalmente en regiones cercanas al cuerpo neuronal. Asimismo, en cultivos bidimensionales con nanoliposomas se observó una mayor tasa de formación de circuitos neuronales y complejidad en las conexiones sinápticas.

Con respecto a la actividad eléctrica de la red neuronal, ésta pudo detectarse luego de 7 días de cultivo con F22 (observación de espigas producidas por neuronas aisladas en cultivos de 5 días). El índice de actividad se estimó al cuantificar el número promedio de espigas por segundo por electrodo activo; dicha tasa fue mayor en la red neuronal bajo el estímulo de los nanoliposomas (14.67 ± 6.41 Hz), en comparación con el grupo control (10.44 ± 2.84 Hz). Asimismo, el número promedio de electrodos activos que detectó un mínimo de 3 espigas fue superior en los cultivos que crecieron en presencia de F22 (18.76 ± 5.36) respecto del control (13.33 ± 5.68). Si bien la actividad electrofisiológica fue mayor en la red neuronal en presencia de nanoliposomas, no difirió significativamente de la observada en el grupo control.

El estallido de actividad neuronal pudo evaluarse mediante la detección de descargas simultáneas por múltiples electrodos activos en períodos de varios milisegundos a segundos, de lo cual se obtuvo una tasa promedio de estallido de actividad por cada electrodo activo (el primer estallido de actividad se detectó a los 6 y 8 días de cultivo, en los grupos con F22 y control, respectivamente). Dicha tasa fue mayor en los cultivos tratados con nanoliposomas, en comparación con la actividad observada en el control (0.92 ± 0.42 estallidos/min y 0.56 ± 0.36 estallidos/min, respectivamente), como también el número promedio de electrodos activos que detectaron un mínimo de un estallido por minuto (6.38 ± 3.1 y 3.29 ± 2.6, en el mismo orden).

El efecto de la lecitina biomimética sobre el desarrollo de la neurotransmisión se estudió mediante la detección de los cambios en la transcripción del gen SYN1, el cual codifica para la proteína sinapsina I implicada en el control de la secreción de los neurotransmisores, la transmisión sináptica y la maduración de las estructuras nerviosas. Las neuronas cultivadas con F22 por períodos de 7 y 10 días expresaron mayores niveles de ARN mensajero de sinapsina I que las células del grupo control.

► Discusión y conclusión

En el presente artículo se pudo comprobar la importancia de los PUFA en la diferenciación y función de las neuronas corticales primarias y en la formación de circuitos nerviosos. En primer término, se observó que la lecitina biomimética incrementó significativamente la actividad celular (mayor consumo de ATP) luego de sólo 3 días de cultivo. Por otra parte, luego de este período se verificó en dichos cultivos un aumento en la longitud y la ramificación de las neuritas y en la complejidad de los circuitos neuronales. Asimismo, los experimentos electrofisiológicos demostraron la funcionalidad de esta red neuronal de mayor complejidad, ya que se detectó una actividad eléctrica más frecuente en sus neuronas en un intervalo de tiempo más corto que en el control. Dicha actividad se correlacionó con mayores niveles de expresión de sinapsina I, la cual es una proteína reguladora de la transmisión sináptica.

Estos resultados aportan una fundamentación para la realización de estudios futuros relacionados con el potencial terapéutico de F22 en las enfermedades neurodegenerativas.

♦ SIIC- Sociedad Iberoamericana de Información Científica